M2-Piruvato Quinasa fecal (M2-PK) es un nuevo biomarcador útil para diagnosticar la enfermedad inflamatoria intestinal

Introducción

La Enfermedad de Crohn (EC) es una entidad que se caracteriza por la presencia de una inflamación crónica recidivante que puede afectar a cualquier tramo del tubo digestivo (desde la boca hasta el ano), de forma segmentaria, discontinua y con afectación transmural de la pared. No existe ningún síntoma ni signo patognomónico para su diagnóstico, de modo que para diagnosticarla se precisa la combinación de una serie de datos clínicos, radiológicos, endoscópicos e histológicos que lo indiquen, al tiempo que se descartan otras enfermedades que pueden cursar con una clínica similar[1].

La EC puede presentar distintos grados de actividad como son: Remisión, actividad leve, moderada o grave. Para evaluar dicha actividad se han desarrollado una serie de índices clínicos y endoscópicos específicos, como son el CDAI y el SES-CD respectivamente.

Índice de actividad en la enfermedad de Crohn (CDAI)

El índice clínico más frecuentemente utilizado es el CDAI (Crohn Disease Activity Index). Es el principal índice validado por las guías de consenso en la práctica clínica. Valora de forma cuantitativa ocho parámetros: siete clínicos y uno analítico, por ello es un índice más de gravedad clínica que de actividad inflamatoria. Cada parámetro es multiplicado por un factor obteniéndose una cifra final para cada uno cuya suma total determina un resultado numérico que nos permite definir el grado de actividad de la enfermedad del paciente. El rango de los distintos grados es: Remisión < 150 puntos, actividad leve 150-219 puntos, actividad moderada 220-450 puntos y actividad grave > 450puntos[2].

Índices endoscópicos en la enfermedad de Crohn

Desde 1989 se han desarrollado índices para definir la actividad o gravedad en la EC a partir de los hallazgos endoscópicos. El más conocido es el CDEIS (Crohn´s Disease Endoscopic Index of Severity) creado por el grupo francés GETAID[3]. Es un índice que presenta gran complejidad ya que todas las lesiones deben medirse en centímetros y posteriormente aplicar los distintos factores multiplicadores. Es utilizado sólo en ensayos clínicos. En el año 2004 un grupo italiano desarrollo un índice más sencillo denominado SES-CD (Simple Endoscopic Score for Crohn´s Disease). El SES-CD clasifica la actividad endoscópica en función de las características de las lesiones presentes a nivel de colon e íleon. Valora la presencia de lesiones en 5 tramos: Recto, colon izquierdo, colon transverso, colon derecho e íleon. La suma total nos permite clasificar al paciente en función del grado de actividad endoscópico según el valor obtenido: Remisión ≤ 3 puntos, actividad leve 4-10 puntos, actividad moderada 11-19 puntos y actividad grave ≥ 20 puntos[4]. Un estudio reciente llevado a cabo por Sipponen T. y colaboradores ha comparado ambos índices endoscópicos observándose una estrecha correlación entre ellos[5].

Biomarcadores fecales

Desde hace aproximadamente 20 años se determinan y se estudian biomarcadores fecales en la EII y más en concreto en la EC. El principal biomarcador fecal es la calprotectina. Se han determinado nuevos biomarcadores fecales como es la M2-PK que ha demostrado su utilidad para ayudar a diagnosticar la EII distinguiéndola del síndrome de intestino irritable (SII).

M2-PK es una isoforma especial de la piruvato quinasa, enzima clave de la glicolisis, que se expresan en células que tienen vida media corta por estar en continua replicación como son las células que componen la mucosa intestinal[6]. Los niveles elevados pueden detectarse en suero y heces. La determinación de M2-PK en heces es una prueba sencilla y de bajo coste que se realiza mediante una técnica de ELISA similar a la utilizada para determinar calprotectina. Las concentraciones son estables a temperatura ambiente hasta 3 días o hasta un año a -20ºC[7]. Existen varios estudios que han confirmado que M2-PK es un marcador biológico útil para diagnosticar EII distinguiéndola del SII pero sólo en un subanálisis de uno de ellos se afirma que puede existir correlación con el grado de actividad en la EII[8]-[10], por lo que la utilidad de M2-PK en la EII aún no se ha determinado con exactitud.

La calprotectina es una proteína presente en el citoplasma de los granulocitos que representa el 60% de las proteínas citosólicas[11]. La presencia de calprotectina en las heces es directamente proporcional a la migración de los neutrófilos hacia el tracto intestinal como se ha descrito en la EII[12]. Su cuantificación se realiza mediante una técnica de ELISA, sencilla y también de bajo coste, con una única muestra de heces (5 gr.), para determinar este marcador de modo fiable. Varios estudios han confirmado una fuerte correlación directa entre los valores de calprotectina fecal y la actividad de la EC evaluada por índices clínicos, endoscópicos e incluso histológicos[13-15].

La colonoscopia con toma de biopsia se considera el "Gold Standart" para evaluar la presencia de inflamación, la localización y la gravedad en la EC. Pero esta es una prueba compleja, de coste elevado, invasiva, en ocasiones rechazada por el paciente y con una importante lista de espera. En los últimos años varios estudios han demostrado que los biomarcadores fecales son herramientas precisas para predecir presencia de inflamación en la EC[16]. La calprotectina fecal es el biomarcador más estudiado y parece ser el más preciso para definir actividad. Consideramos que M2-PK puede ser un biomarcador válido para determinar presencia de inflamación a nivel intestinal incluso puede ser un biomarcador complementario con calprotectina ya que tiene un origen distinto (M2-PK: enterocito y Calprotectina: leucocitos) a diferencia de otros biomarcadores fecales como lactoferrina o elastasa de los polimorfonucleares.

Nuestro principal objetivo fue determinar la verdadera validez diagnóstica de M2-PK fecal para predecir actividad endoscópica y clínica en la EC comparada con calprotectina, PCR y VSG.

Material, método y análisis estadístico

Pacientes

Realizamos un estudio de validación de prueba diagnóstica en el cual participaron 58 pacientes. Participaron 58 pacientes que se seleccionaron en base a estos criterios de inclusión: diagnóstico de EC en base a criterios clínicos endoscópicos e histológicos, edad superior a 16 años y firma de consentimiento informado específico para este estudio aprobado por el comité de ética del hospital Juan Ramón Jiménez. Se consideraron criterios de exclusión: presencia de cuadro infeccioso agudo o enfermedad inflamatoria distinta de EC, extensas resecciones intestinales (colectomía total o subtotal) o consumo de AINES de forma crónica. El período de captación de pacientes fue de 18 meses (desde Enero de 2011 hasta Junio de 2012).

Método

Se captaron a pacientes desde la consulta monográfica de EII y también desde la planta de hospitalización de Aparato Digestivo de nuestro hospital. A todos los pacientes se les realizó analítica de sangre para determinar cifras de PCR, VSG y hemograma. También se recogió dos muestras de heces para determinar los niveles de calprotectina y M2-PK fecal, estas muestras fuerón conservadas a -20º C y posteriormente se mandaron a un laboratorio externo que realizó la determinación de cada biomarcador mediante una técnica de ELISA. El ánalisis de sangre y la recogida de heces se realizó el mismo día. Se realizó además coprocultivo, estudio de parásitos y de toxina de Clostridium Difficle en heces incluyéndose sólo a los pacientes en los que estas tres determinaciones fueron negativas. Se recogieron datos clínicos de cada paciente que nos permitieron calcular el CDAI. Este índice valora ocho parámetros: siete clínicos (número de deposiciones blandas o líquidas durante 7 días consecutivos, presencia y grado de dolor abdominal durante 7 días consecutivos, valoración del pacientes del bienestar general durante 7 días consecutivos, número de complicaciones o manifestaciones de la enfermedad, consumo de fármacos para controlar la diarrea, presencia de masa inflamatoria abdominal y pérdida de peso) y uno analítico (hematocrito). Se realizó en todos los pacientes una ileocolonoscopia completa, previa preparación con solución evacuante Bohm, observando el aspecto de la mucosa y la presencia de lesiones en cada uno de los tramos colónicos e íleon terminal para el cálculo del SES-CD que valora 4 parámetros: presencia de úlceras y tamaño, porcentaje de superficie ulcerada, porcentaje de superficie inflamada y presencia de estenosis. Estos se determinan en 5 tramos: recto, colon izquierdo, colon transverso, colon derecho e íleon. Finalmente obtenemos una puntuación de cada índice y clasificamos a los pacientes en dos grupos según estén en remisión o presenten actividad de la enfermedad desde el punto de vista clínico y endoscópico. Se define remisión clínica para un CDAI < 150 y actividad clínica para CDAI ≥ 150) del mismo modo que remisión endoscópica para SES-CD ≤ 3 y actividad endoscópica para SES-CD > 3.

Análisis estadístico

Inicialmente realizamos un estudio descriptivo de los datos definiendo la edad media de la muestra, distribución de género, edad media de evolución, localización de la enfermedad, distribución por grados de actividad y tratamiento. Posteriormente utilizamos prueba t-student para muestras independientes comparando las medias de los biomarcadores entre el grupo que estaba en remisión y el grupo que presentaba actividad de la enfermedad. Calculamos la correlación, utilizando prueba de rho de Spearman, de la M2-PK y los otros biomarcadores con respecto a ambos índices de actividad conformando un cuadro de correlaciones. Finalmente se calcularon las curvas ROC de la M2-PK y los otros biomarcadores con respecto a ambos índices de actividad estimando el área bajo la curva y el punto de corte óptimo que permita definir con mayor precisión la presencia de actividad clínica y endoscópica obteniéndose las mejores cifras de sensibilidad (S), especificidad (E), valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) para establecer actividad clínica y endoscópica.

Resultados

Estudio descriptivo (Tabla 1)

Se seleccionaron 58 pacientes (27 hombres y 31 mujeres), con edad media de 42 años (16-69), la media de años de evolución de la enfermedad fue de 6 años (0-26 años). La localización más frecuente fue la ileo-cólica (41%), seguido de la ileal (33%) y finalmente la colónica (26%). 30 pacientes presentaban actividad clínica (15 leve, 14 moderada y 1 grave) y 28 estaban en remisión mientras que 40 pacientes presentaban actividad endoscópica (22 leve, 14 moderada y 2 grave) y 18 remisión. Respecto al tratamiento 10 pacientes (17%) no realizaba ningún tratamiento, 30 pacientes (52%) mesalazina, 10 pacientes (17%) prednisona, 12 pacientes (20%) azatioprina y 5 pacientes (8%) anti-TNF.

Comparación de medias

Se dividieron a los pacientes en 2 grupos según presentasen actividad o remisión desde el punto de vista clínico y también endoscópico. Con respecto al SES-CD los valores de M2-PK y calprotectina fecal presentaban diferencias significativas (p < 0.05), pero las diferencias entre los niveles de PCR y VSG no fueron significativas (p >0.05) entre ambos grupos (Tabla 2). Con respecto al CDAI los valores de los 4 biomarcadores presentaron diferencias significativas (p < 0.05) entre ambos grupos remisión-actividad (Tabla 3).

Comparamos las medias de los biomarcadores entre los pacientes con sólo afectación ileal y el resto (colónica e ileocólica). M2-PK y calprotectina presentaron niveles inferiores en los pacientes con actividad con afectación exclusivamente ileal (M2-PK: 7.7 U/l vs 12 U/l; Calprotectina 176 µg/g vs 272 µg/g) con diferencias significativas (p = 0.45 y p = 0.40 respectivamente). No se observaron diferencias entre los niveles de PCR y VSG en cuanto a la localización de la enfermedad.

Correlaciones entre biomarcadores, CDAI y SES-CD

Se determinó la correlación entre SES-CD, CDAI, M2-PK fecal, calprotectina fecal, PCR y VSG realizando un test de rho de Spearman conformándose un cuadro de correlaciones (Tabla 4).

Biomarcadores fecales

M2-PK presentó correlación positiva con SES-CD (r = 0.50; p < 0.01) y CDAI (r = 0.25; p = 0.03). Calprotectina mostró una fuerte correlación positiva con SES-CD (r = 0.70; p < 0.01) y también positiva con CDAI (r = 0.53; p < 0.01). Todas las correlaciones fueron estadísticamente significativas, siendo la correlación entre ambos biomarcadores la que presentó mayor fuerza (r = 0.80; p < 0.01). También se observó una fuerte correlación entre ambos índices de actividad (r = 0.70; p < 0.01).

Biomarcadores serológicos

PCR presentó correlación positiva con SES-CD y CDAI (r=0.52; p < 0.01 y r=0.52; p < 0.01, respectivamente). También VSG presentó correlación positiva, aunque más débil que la PCR, para ambos índices (r=0.40; p < 0.01 y r=0.40; p < 0.01, respectivamente).

Curvas ROC entre biomarcadores e índices de actividad (Figura 1)

Figura 1

Curvas ROC

SES-CD y biomarcadores

M2-PK, Calprotectina, PCR y VSG presentaron un área bajo la curva (AUC) con respecto al SES-CD de 0.78 (p < 0.01), 0.89 (p < 0.01), 0.69 (p = 0.02) y 0.66 (p = 0.04) respectivamente. Ambos biomarcadores fecales presentaron S 85%, E 78%, VPP 89% y VPN 71% para establecer actividad endoscópica con un punto de corte óptimo de 4.5 U/l para M2-PK y 130 µg/g para calprotectina (Tabla 5).

CDAI y biomarcadores

M2-PK, calprotectina, PCR y VSG presentaron AUC con respecto CDAI de 0.65 (p = 0.04), 0.83 (p < 0.01), 0.80 (p < 0.01) y 0.72 (p = 0.04) respectivamente. M2-PK presentó sensibilidad 67% y especificidad 65% para un punto de corte óptimo de 7 U/l y calprotectina sensibilidad 79% y especificidad 76% para un punto de corte óptimo de 190 µg/g para establecer actividad clínica (Tabla 6).

Discusión

La EII activa se acompaña de un aumento de la renovación celular en la mucosa intestinal lo que conlleva un aumento de la división celular y por lo tanto unos niveles mayores de M2-PK en heces. En este sentido, M2-PK ha mostrado resultados prometedores en un estudio piloto cuyo objetivo fue poner de relieve el valor potencial de M2-PK como marcador indirecto de la inflamación en pacientes con EII en comparación con los pacientes con síndrome de intestino irritable (SII)8. Otro estudio donde se correlacionaban los valores de M2-PK y calprotecina fecal para diferenciar entre enfermedad orgánica (EII o Cancer colorectal) y funcional (SII) donde se realiza un análisis subgrupo en que se evidencia que hay diferencias importantes de ambos marcadores fecales entre EII activa y no activa demostrándose una fuerte correlación lineal entre ambos marcadores, este es el primer estudio que ha puesto en evidencia la elevación de la M2-PK en EII activa y además afirma que puede existir correlación directa entre la M2-PK y el grado de actividad de la enfermedad9. En otro estudio más actual se compararon M2-PK y calprotectina en heces para diferenciar entre enfermedad intestinal orgánica o funcional ambos marcadores se mostraron útiles aunque la calprotectina mostró mayor sensibilidad, especificidad y valor predictivo positivo aunque las diferencias no fueron significativas, en este estudio de 105 pacientes estudiados sólo 14 presentaron enfermedad orgánica intestinal y de estos únicamente 9 pacientes fueron diagnosticados de EC, por lo que es un estudio en el las diferencias entre ambos biomarcadores en los pacientes con EC es poco valorable10. En nuestro estudio observamos que M2-PK es un biomarcador válido, y con alta precisión, para poder predecir actividad endoscópica (AUC 0.78, S 85%, E 78%, VPP 89, VPN 71) con un punto de corte de 4.5 U/l. Aunque presenta una baja precisión para definir actividad clínica (AUC 0.65, S 67%, E 65%, VPP 63, VPN 60) para un punto de corte de 7 U/l.

Calprotectina es el biomarcador que ha presentado mayor correlación con todos los índices de actividad utilizados en la mayoría de los estudios. En concreto en la EC se ha observado en varios estudios una fuerte correlación entre los valores de calprotectina fecal y la actividad evaluada por parámetros clínicos, endoscópicos e incluso histológicos13-15. Nuestros resultados confirman que es el biomarcador más preciso para establecer actividad clínica pero sobre todo actividad endoscópica con una alta precisión diagnóstica (AUC 0.89, S 85%, E 78%, VPP 89, VPN 71) con un punto de corte establecido en 130 µg/g. También presenta buena precisión para definir actividad clínica (AUC 0.83, S 79%, E 78%, VPP 75, VPN 74) para un punto de corte de 190 µg/g. Nuestros resultados muestran que calprotectina fecal es más precisa que M2-PK, PCR y VSG para predecir actividad endoscópica y clínica.

La PCR fue la primera proteína de fase aguda descrita. Se sintetiza en el hígado. Tiene una vida media corta, por lo que se eleva precozmente al inicio del proceso inflamatorio y disminuye rápidamente tras su resolución[18]. En la EC, PCR han mostrado correlación directa con el CDAI y el CDEIS[19]. En general se ha demostrado que la PCR es el marcador serológico que más estrechamente se correlaciona con la actividad clínica de la enfermedad[12]. La VSG cuantifica la velocidad con la que los hematíes sedimentan en un tubo capilar. La presencia de reactantes de fase aguda acelera dicha velocidad. Diversos estudios han demostrado una correlación positiva con la actividad clínica de los pacientes con EC20-21. Nuestros resultados evidencian que PCR y VSG presentan menor precisión que M2-PK y calprotectina para predecir actividad endoscópica, aunque son más precisos que M2-PK para establecer actividad clínica.

En cuanto a los valores de los biomarcadores según la localización de la enfermedad se observó que existen diferencias en los niveles de M2-PK y calprotectina entre los pacientes que presentaban actividad sólo a nivel ileal o actividad a nivel de colon o de ambas localizaciones (ileo-cólica). Sipponen y cols encuentran diferencias similares entre los pacientes con afectación ileal en los niveles de calprotectina y lactoferrina fecal con respecto a la localización cólica o ileo-colica, incluso concluye que en la afectación exclusiva del íleon unos valores normales de biomarcadores fecales no excluye la existencia de actividad[22]. Aunque en nuestro estudio los niveles de M2-PK y calprotectina son inferiores en los pacientes con afectación sólo a nivel ileal, las cifras de los biomarcadores fecales se encuentran por encima del punto de corte óptimo para definir actividad y por lo que las diferencias pueden explicarse quizás porque en el grupo de afectación ileal la extensión de la enfermedad es menor mientras que en la afectación cólica o ileo-colica la afectación es más extensa y puede existir mayor liberación de biomarcadores en las heces. Estas diferencias no existen con los biomarcadores serológicos PCR y VSG.

Para futuros avances en esta línea de investigación consideramos que sería interesante corroborar estos resultados con una muestra mayor de pacientes analizando también la complementariedad de estos biomarcadores, probable entre calprotectina y M2-PK por derivar de células distintas (leucocitos y enterocitos), para predecir actividad endoscópica con mayor precisión. Por ello seguiremos incorporando pacientes a este estudio y realizaremos nuevos análisis estadísticos.

Conclusiones

M2-PK fecal es un biomarcador válido y con alta precisión para predecir actividad endoscópica en la EC siendo superiores a PCR y VSG. M2-PK fecal es válido para definir actividad clínica pero menos preciso que calprotectina fecal, PCR y VSG. Calprotectina fecal presenta mayor precisión diagnóstica que M2-PK, PCR y VSG para predecir actividad clínica y endoscópica en la EC.